吡啶甲酸鉻安全性研究進(jìn)展
最近由于毒膠囊事件，大家談鉻色變。實(shí)際上有毒的是六價(jià)鉻，三價(jià)鉻還可以用作食品和飼料添加劑。下面的文章介紹了吡啶甲酸鉻的安全性。
作者簡(jiǎn)介：畢晉明，北京華谷生物營(yíng)養(yǎng)科技發(fā)展有限公司，碩士。
張敏紅，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)方面研究礦物元素是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的一大類(lèi)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)素。目前已查明的必需微量元素有鐵、鋅、銅、錳、碘、硒、鈷、鉬、氟、鉻、硼等12種，且必須由外界供給。各元素在供給量上存在一安全范圍，添加量不足導(dǎo)致相應(yīng)元素缺乏癥，添加量超過(guò)安全范圍便導(dǎo)致機(jī)體中毒。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，畜禽對(duì)微量元素的耐受性也隨動(dòng)物種類(lèi)而異。豬、禽對(duì)鐵的耐受量為3000mg/kg、1000mg/kg，對(duì)銅的耐受量為250mg/kg、300mg/kg，其他微量元素同樣具有類(lèi)似效應(yīng)。當(dāng)微量元素在飼糧中含量較低時(shí)為必需礦物元素，在含量過(guò)高情況下則可能是有毒有害元素，必需礦物元素和有毒有害元素對(duì)動(dòng)物而言是相對(duì)的。
鉻元素作為必需微量元素之一，其生理作用日益受到研究者重視。研究表明：鉻與糖代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝以及核酸代謝密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，各種動(dòng)物對(duì)鉻的耐受力都較強(qiáng)?？赡褪茔t的氧化物3000mg/kg，鉻的氯化物可耐受1000mg/kg。吡啶甲酸鉻作為有機(jī)鉻制劑，其安全性也日益受到關(guān)注。在畜牧生產(chǎn)上，吡啶甲酸鉻對(duì)緩解環(huán)境應(yīng)激、提高瘦肉率、增強(qiáng)抵抗力均有明顯的促進(jìn)作用，而被廣泛應(yīng)用。但究其使用量而言，雖然一些國(guó)家已批準(zhǔn)吡啶甲酸鉻在畜禽日糧中的添加，但目前尚未正式發(fā)布動(dòng)物最低需要量和最高耐受量數(shù)據(jù)。研究報(bào)道，血漿鉻的正常生理濃度為0.1-2.1μg/ml(Cerullietal.,1998)，人類(lèi)肝中鉻的生理濃度為5.4-470ηg/g肝濕重（－0.1-9μM）（Versieck，1985），超量添加（遠(yuǎn)高于生理劑量）吡啶甲酸鉻有可能產(chǎn)生DNA毒性和細(xì)胞毒性。為此，本文對(duì)吡啶甲酸鉻的安全性進(jìn)行綜述，以便為日后吡啶甲酸鉻的研究提供理論基礎(chǔ)。
1、吡啶甲酸鉻理化特性及結(jié)構(gòu)特征
吡啶甲酸鉻（Chromiumpicolinate），分子式Cr(C6H4NO2)3，分子量為418.33，紫紅色結(jié)晶性細(xì)小粉末，常溫下穩(wěn)定，微溶于水，不溶于乙醇。整個(gè)分子結(jié)構(gòu)呈電中性，且具有疏水特性，因此可以以完整的結(jié)構(gòu)進(jìn)行跨膜吸收。吡啶甲酸鉻的分子結(jié)構(gòu)與GTF部分相似。1977年，Toepfer認(rèn)為GTF是鉻的生物活性形式，其結(jié)構(gòu)為煙酸-鉻-煙酸與天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸形成的配合體。吡啶甲酸鉻的類(lèi)GTF結(jié)構(gòu)決定了自身較好的吸收率，并能更有效地發(fā)揮自身的生物學(xué)功能。據(jù)報(bào)道，普通鉻制劑吸收率為0.5%左右，而吡啶甲酸鉻吸收率達(dá)2%－5%（Anderson，1996）。
2、吡啶甲酸鉻安全性研究
吡啶甲酸鉻作為營(yíng)養(yǎng)添加劑，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。但是從1995年首次報(bào)道了吡啶甲酸鉻的危害性之后，吡啶甲酸鉻的安全性問(wèn)題就一直成為研究的熱點(diǎn)。迄今為止，對(duì)吡啶甲酸鉻的安全性研究已得到一些數(shù)據(jù)，但結(jié)論不盡相同。
據(jù)NTP（NationalToxicologyProgram）報(bào)道，不管有無(wú)添加小鼠肝臟S9代謝激活物，吡啶甲酸鉻對(duì)TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102、TA104細(xì)胞株均未致突變性。在小鼠日糧中添加2500mg/kg.bw的一水吡啶甲酸鉻，小鼠骨髓細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)基因斷裂效應(yīng)。Kato等（1998）對(duì)十位肥胖女士（每日服用400mg吡啶甲酸鉻）觀察，八周后尿樣中DNA堿基氧化產(chǎn)物5-羥甲基尿嘧啶水平?jīng)]有發(fā)生變化。Anderson等(1997)向小鼠日糧中添加100mg/kg日糧的鉻（吡啶甲酸鉻形式），飼喂24周也未發(fā)現(xiàn)吡啶甲酸鉻急性毒性。
針對(duì)超量添加吡啶甲酸鉻時(shí)的細(xì)胞毒性和基因毒性也有研究報(bào)道。吡啶甲酸鉻細(xì)胞毒性主要體現(xiàn)在細(xì)胞凋亡和線粒體損傷上。Manygoats(2002)研究發(fā)現(xiàn)，1mM（125倍適宜量）吡啶甲酸鉻添加可導(dǎo)致線粒體損傷和細(xì)胞凋亡，可能是由于線粒體呼吸作用受到抑制（主要發(fā)生在復(fù)合體Ⅰ上），NADH的合成減少，消耗增大所致；線粒體內(nèi)膜通道的破壞（線粒體的滲透性轉(zhuǎn)換孔—MPT途徑），導(dǎo)致線粒體基質(zhì)成分喪失，線粒體功能和細(xì)胞器發(fā)生實(shí)質(zhì)性膨脹，接著線粒體外膜破裂，細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子釋放，進(jìn)而激活核酸內(nèi)切酶和Caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡(GreenD等,1998)。
吡啶甲酸鉻基因毒性主要表現(xiàn)在DNA堿基氧化、DNA鏈斷裂和基因突變上。Hepburn(2003)研究發(fā)現(xiàn)：給小鼠注射吡啶甲酸鉻80天后（~600uMCr,75倍適宜量），造成脂質(zhì)過(guò)氧化，并使尿中DNA堿基氧化產(chǎn)物8-oxo-dG含量升高。另有報(bào)道提示：在諸如維生素C之類(lèi)的生物抗氧化劑存在的條件下，吡啶甲酸鉻可以斷裂DNA雙鏈，使超螺旋DNA松弛。Stohs(1998)等研究發(fā)現(xiàn)，50mg/ml（120mM）吡啶甲酸鉻處理巨噬細(xì)胞J774A.124h后，造成DNA鏈斷裂，細(xì)胞中存在DNA碎片。SpeetjensJK(1999)的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：吡啶甲酸鉻可以導(dǎo)致質(zhì)粒DNA單鏈斷裂。在小鼠淋巴細(xì)胞上的毒理試驗(yàn)表明：不管是否添加S9，1.2mM（150倍適宜量）、2.39mM吡啶甲酸鉻均顯著誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞基因突變（Whittaker等，2005）。
由此可見(jiàn)，在體內(nèi)研究吡啶甲酸鉻的安全性上，除靜脈注射途徑外，未見(jiàn)毒性報(bào)道。這可能與吡啶甲酸鉻的吸收率（2%－5%）以及機(jī)體內(nèi)環(huán)境代謝有關(guān)；吡啶甲酸鉻靜脈注射途徑的吸收率遠(yuǎn)高于腸道吸收率。體外細(xì)胞培養(yǎng)研究上，多數(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)道，超量添加吡啶甲酸鉻（>0.6mM，75倍適宜量）對(duì)細(xì)胞和DNA產(chǎn)生毒性作用。但也有個(gè)別試驗(yàn)報(bào)道，高劑量吡啶甲酸鉻（>0.6mM）對(duì)細(xì)胞和DNA不產(chǎn)生毒性作用，這可能與不同細(xì)胞株的耐受性不同和吡啶甲酸鉻的吸收率降低有關(guān)。
3、超量添加吡啶甲酸鉻毒性作用的代謝途徑
迄今為止，從國(guó)內(nèi)外吡啶甲酸鉻安全性研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，吡啶甲酸鉻毒性作用與其代謝途徑密切相關(guān)，其代謝途徑主要?dú)w納為兩條。
3.1吡啶甲酸鉻氧化-還原途徑
吡啶甲酸鉻在胞內(nèi)還原劑（維生素C，硫醇等）存在的條件下發(fā)生類(lèi)Fenton反應(yīng)。在此過(guò)程中生成大量對(duì)DNA穩(wěn)定性影響的ROS，如超氧離子，過(guò)氧離子，羥基自由基，過(guò)氧化氫等。ROS的產(chǎn)生，使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化生成羰基蛋白、脂質(zhì)過(guò)氧化物等氧化產(chǎn)物，同時(shí)使細(xì)胞膜通透性、膜流動(dòng)性降低，細(xì)胞脆性升高，細(xì)胞完整性遭到破壞。另一方面，ROS產(chǎn)生后降低了Ca2+-ATP酶與鈣通道活性，造成Ca超載，從而激活Ca2+-依賴蛋白酶，磷脂酶（PLA2）及核酸內(nèi)切酶（劉欣等，2001）。PLA2的激活,使膜磷脂降解,磷脂含量降低,導(dǎo)致膜通透性增加,Ca2+易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，形成惡性循環(huán)。核酸內(nèi)切酶的激活,催化基因組DNA在核小體間降解;Ca2+濃度的升高還可激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)化酶和蛋白激酶C等,使細(xì)胞骨架斷裂,細(xì)胞漿蛋白交叉聯(lián)合,促使凋亡發(fā)生（Ui-Tei等，2000）。此外，Ca2+濃度的改變還可激活凋亡相關(guān)蛋白激酶與Caspase家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Fenton反應(yīng)增強(qiáng)后，ROS基團(tuán)可氧化DNA堿基。通過(guò)脫氧核糖的C8位點(diǎn)上的脫氫作用氧化DNA，使鳥(niǎo)嘌呤氧化成為8-oxo-dG；胸腺嘧啶氧化生成5-羥甲基尿嘧啶。
3.2吡啶甲酸鉻酶促分解途徑
在胰島素依賴性細(xì)胞中，Apo-LMWCr從吡啶甲酸鉻復(fù)合體中對(duì)鉻進(jìn)行吸附，使吡啶甲酸脫離復(fù)合物，游離于胞內(nèi)，從而造成細(xì)胞毒性。在體內(nèi)吡啶甲酸是色氨酸的代謝產(chǎn)物，它的產(chǎn)生可以誘導(dǎo)一氧化氮合酶表達(dá)，導(dǎo)致氮自由基產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。吡啶甲酸還可改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，并能阻止細(xì)胞周期（S期）循環(huán)。毒理學(xué)試驗(yàn)表明：吡啶甲酸在胞內(nèi)可以螯合其他金屬離子發(fā)生Fenton反應(yīng)生成活性氧自由基，并且發(fā)現(xiàn)在磷酸鹽緩沖液中，吡啶甲酸能增強(qiáng)Cr(pic)3的類(lèi)Fenton反應(yīng)。Stearns(2002)研究發(fā)現(xiàn)：1mM（120倍適宜量）的吡啶甲酸鉻處理組48h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率為（68±16）%，而吡啶甲酸組僅為27%；但是發(fā)現(xiàn)該濃度的吡啶甲酸并不存在致突變性。Manygoats(2002)等對(duì)CHO細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)：吡啶甲酸鉻添加量為1mM時(shí)，48h后發(fā)現(xiàn)37%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，當(dāng)量的吡啶甲酸產(chǎn)生的細(xì)胞毒性比吡啶甲酸鉻更強(qiáng)，1.5mM（180倍適宜量）的吡啶甲酸處理組的細(xì)胞成活率僅有49%，51%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，71%的線粒體受損。另有研究發(fā)現(xiàn)：3mM濃度的吡啶甲酸24h后發(fā)現(xiàn)線粒體損傷，5－10mM的吡啶甲酸12－24h后細(xì)胞發(fā)生凋亡（Ogata等，1998）?？梢?jiàn)在細(xì)胞毒性上，吡啶甲酸強(qiáng)于吡啶甲酸鉻。
在微粒體中吡啶甲酸鉻可分解并發(fā)生醯胺化、甲基化反應(yīng)。將人微粒體與吡啶甲酸鉻共同孵育1h和3h后，分析得出66%的吡啶甲酸鉻被代謝，通過(guò)高壓液相色譜分析兩時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果沒(méi)有差異。為了驗(yàn)證結(jié)果，采用雞肝細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，吡啶甲酸鉻全部被代謝，三價(jià)鉻離子脫離。三價(jià)鉻離子的分離可能會(huì)對(duì)DNA結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制過(guò)程造成負(fù)面影響，從而阻止細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，其可能機(jī)理如下：Cr（Ⅲ）可與磷酸骨架（Tsapakos等，1983）、鳥(niǎo)嘌呤、染色體組蛋白（H2AX）（Miller等，1989）、染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白（SMC）結(jié)合（Timothy，2004），從而影響DNA的復(fù)制進(jìn)程。還可與DNA復(fù)制所需的酶類(lèi)結(jié)合，如拓?fù)洚悩?gòu)酶的結(jié)合，使DNA松弛活性降低，DNA雙鏈不能完全松弛，導(dǎo)致復(fù)制終止；與DNA聚合酶（Tkeshelashvili，1980）、RNA聚合酶（Okada等，1981），翻譯延長(zhǎng)因子復(fù)合體（Wang等，1997）的結(jié)合，導(dǎo)致復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程受阻。
DNA內(nèi)鏈交聯(lián)（ICL）作為DNA加合損傷的另一方式，占DNA-Cr加合物的10%左右，也可阻止DNA的復(fù)制。已有研究報(bào)道：ICL可以與鳥(niǎo)嘌呤上的N-7殘基（Bauer等，1997），以及與磷酸骨架一定程度的結(jié)合，從而物理性地阻止模板DNA的復(fù)制（Bridgewater等，1994）。在細(xì)胞水平上表現(xiàn)為細(xì)胞周期循環(huán)中斷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、程序性死亡。另有資料顯示：Cr-DNA加合物誘導(dǎo)的單堿基的改變通常導(dǎo)致G/C→A/T的轉(zhuǎn)變與G/C→T/A的顛換，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與鉻螯合的配體差異，可導(dǎo)致堿基替代頻率發(fā)生變化（Quievryn等,2003；Zhitkovich等，2001）。
4、結(jié)語(yǔ)
適宜量吡啶甲酸鉻添加對(duì)機(jī)體代謝有著積極作用，當(dāng)添加量遠(yuǎn)高于生理劑量時(shí)有可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性和DNA毒性。在體內(nèi)研究吡啶甲酸鉻的安全性上，除靜脈注射途徑外，未見(jiàn)毒性報(bào)道。在體外研究上，超量添加吡啶甲酸鉻（>0.6mM）時(shí)可能出現(xiàn)細(xì)胞毒性和DNA毒性。其毒性作用與其代謝途徑密切相關(guān)，但作用機(jī)理尚不完全清楚，有待于進(jìn)一步研究探索。
